Methoden - Fluoreszenzmikroskopie

Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie können gezielt Strukturen und sogar einzelne Moleküle innerhalb einer Zelle spezifisch sichtbar gemacht werde. Für die Markierung der Zielstrukturen stehen verschiedene Methoden zur Verfügung:

  • (i) Färbung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die eine hohe Affinität zur Zielstruktur besitzen ,
  • (ii) Einsatz von Fluoreszenzmarkierten Antikörpern bzw. Molekülen als Sonden,  die spezifisch an die untersuchte Struktur binden und
  • (iii) die Fusion des zu untersuchenden Proteins mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) bzw. einem der zahlreichen verfügbaren GFP Derivate (CFP, YFP, RFP etc.).

Unter Ausnutzung physikalischer Effekte, wie z.B. dem Förster-Resonanzenergietransfer (FRET), können Interaktionen zwischen einzelnen Molekülen mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden.

Gezieltes Bleichen bestimmter Bereiche innerhalb eines Präparats (z.B. FRAP: Fluorescence Recovery after Photobleaching), ermöglicht die Beobachtung der dynamischen Verteilung fluoreszierender Strukturen (z.B. Vesikeltransport, Stoffaustausch  zwischen Zellkompartimenten).

Mit Hilfe der ratiometrischen Fluoreszenzmikroskopie kann man Konzentrationsänderungen einzelner Ionen (z.B. Ca2+) oder pH-Wert Änderungen innerhalb der Zelle messen.

Der große Vorteil der Fluoreszenzmikroskopie besteht in der Tatsache, dass diese Untersuchungen an lebenden Zellen durchgeführt werden können, da eine Fixierung bzw. Entwässerung der Proben, wie es z.B. für die Elektronenmikroskopie nötig ist, entfällt.

Die konventionelle Epifluoreszenz-Mikroskopie eignet sich besonders für die Untersuchung von dünnen und sehr empfindlichen, lebenden Proben, da sie eine schnelle Bildaufnahme bei hoher Sensitivität ermöglicht. Der Nachteil dieser Methode besteht jedoch darin, dass auch Licht oberhalb und unterhalb der Fokusebene vom Objektiv gesammelt und am Detektor abgebildet wird. Dies führt zu einer starken Abnahme des Signal-Rausch-Verhältnisses und zu einer deutlichen Beeinträchtigung der Bildqualität. Dieses Problem kann mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie überwunden werden. Hierbei wir das Präparat Punkt für Punkt und zeilenweise mit einem Laserstrahl beleuchtet, während zeitgleich eine spezielle Lochblende (Pinhole) vor dem Detektor dafür sorgt, dass nur Licht aus der Fokusebene detektiert wird. Auf diese Weise können sehr scharfe Bilder von unterschiedlichen Präparatebenen erzeugt werden. Anschließend können diese Einzelbilder für die räumliche Rekonstruktion des untersuchten Objekts genutzt werden.